Лабораторные методы исследования. Протеинурия. Определение белка в моче - практические навыки педиатра

Для клиники имеет значение как качественное, так и количественное определение белка в моче.

Качественные пробы определения белка в моче
Предложено более 100 реакций качественного определения белка в моче. Большинство из них основаны на осаждении белка физическими (нагреванием) или химическими средствами. Наличие белка доказывается появлением мути.

Представляют интерес также и колориметрические сухие пробы.

Ниже будут описаны только наиболее важные для практики пробы.

Проба с сульфосалициловой кислотой . К нескольким миллилитрам мочи прибавляют 2-4 капли 20% раствора сульфосалициловой кислоты. При положительной реакции появляется муть. Результат обозначают терминами: опалесценция, слабо положительная, положительная или сильно положительная реакция. Проба с сульфосалициловой кислотой одна из самых чувствительных проб для установления белка в моче. Ею обнаруживаются даже самые незначительные патологические увеличения белка в моче. Благодаря простой технике эта проба нашла широкое применение.

Проба с асептолом . Асептол является заместителем сульфосалициловой кислоты. Его можно приготовить из имеющихся в любой лаборатории материалов (фенола и серной кислоты). В качестве реактива употребляют 20% раствор асептола. Проба проводится следующим образом: в пробирку, содержащую 2-3 мл мочи, подслаивают на дно 0,5-1 мл раствора асептола. Если на границе между двумя жидкостями получится белое кольцо из свернувшегося белка, проба положительна.

Проба Геллера . Под несколько миллилитров мочи подслаивают 1-2 мл 30% азотной кислоты (уд. вес 1,20). Если на границе обеих жидкостей получится белое кольцо, проба положительна. Реакция становится положительной, если белка больше 3,3 мг%. Иногда белое кольцо получается при наличии больших количеств уратов. В отличие от белкового кольца, уратное кольцо появляется не на границе между обеими жидкостями, а немного выше. Ларионова предлагает вместо 30% азотной кислоты употреблять в качестве реактива 1% раствор азотной кислоты в насыщенном растворе поваренной соли; это дает большую экономию азотной кислоты.

Проба с железистосинеродистым калием и уксусной кислотой . Эта реакция дает возможность отграничить белки сыворотки от нуклеоальбуминов.

В две пробирки наливают равные количества мочи. В одну из них добавляют несколько капель 30% раствора уксусной кислоты. Если получится муть по сравнению с контрольной пробиркой, моча содержит нуклеоальбумин. Если муть не появится, содержимое обеих пробирок смешивают и вновь разделяют на две части. В одну из двух пробирок добавляют несколько капель (избыток может превратить положительную пробу в отрицательную) 10% раствора желтой кровяной соли (железистосинеродистого калия). При наличии протеинов сыворотки получается муть.

При концентрированной моче, содержащей большие количества мочевой кислоты и уратов, пробу с железистосинеродистым калием и уксусной кислотой следует производить после предварительного разведения (в 2-3 раза) мочи водой. В противном случае может наступить помутнение, вызванное осевшей мочевой кислотой.

Это имеет особенно важное значение при исследование мочи грудных детей, содержащей много мочевой кислоты и уратов.

Из остальных качественных проб на белок в моче, основанных на осаждении белков, применение нашли: проба кипячением, пробы Эсбаха, Пэрди, Робертса, Альмена, Баллони, Буро, Клаудиуса, Корсо, Домэ, Гудманна-Сюзанна, Жолле, Экстона, Камлета, Кобуладзе, Лилиендаля-Петерсена, Полаччи, Понса, Шпиглера, Танре, Тиле, Броуна, Цушия и др.

При производстве качественных проб на белок в моче, основанных на осаждении белков, необходимо соблюдать следующие общие правила, нарушение которых приводит к значительным ошибкам при исследовании.

1. Исследуемая моча должна иметь кислую реакцию. При щелочной реакции, мочу слегка подкисляют уксусной кислотой. Производство пробы с щелочной мочой в тех случаях, когда используется в качестве реактива кислота, может привести к нейтрализации кислоты и к отрицательному результату при положительной реакции. Это особенно относится к пробе с сульфосалициловой кислотой, т. к. кислота прибавляется в очень малых количествах и легко может быть нейтрализована.

2. Исследуемая моча должна быть прозрачной.

3. Пробы для установления белка в моче следует всегда производить в двух пробирках, одна из которых служит контролем. Без контрольной пробирки можно не заметить легких помутнении при реакциях.

4. Количество прибавляемой кислоты при пробах не должно быть слишком большим. Большое количество кислоты может привести к образованию растворимых ацидальбуминов и к превращению положительной пробы в отрицательную.

Заслуживают большого внимания, благодаря своей простой технике, колориметрические сухие пробы. При этих пробах используется влияние, которое белок оказывает на цвет индикатора в буферном растворе (т. наз. протеиновая ошибка индикаторов). Лента фильтровальной бумаги, пропитанная кислым цитратным буфером и бромфеноловым синим в качестве индикатора, погружается на короткое время в мочу. Проба положительна, если получится сине-зеленая окраска. Сравнивая интенсивность окраски с цветными бумажными стандартами, можно вывести ориентировочно и количественные заключения. Индикаторная бумага продается в пачках с соответственными цветными стандартами, подобно универсальной индикаторной бумаге.

Методы, количественного определения белка в моче
Для количественного определения белка в моче предложено много методов. Точные количественные методы определения белков в биологическом материале не нашли широкого применения при определении белка в моче, вследствие сложной и трудоемкой техники. Широкое распространение получили волюметрические методы, особенно метод Эсбаха. Они очень просты, но, к сожалению, не отличаются большой точностью. Удобны для клиники также и методы группы Брандберга-Стольникова, дающие более точные результаты, чем волюметрические методы, при сравнительно простой технике. При наличии фотометра или нефелометра удобны также нефелометрические методы.

Метод Эсбаха . Он предложен парижским врачом Эсбахом в 1874 г. В специальную пробирку (альбуминометр Эсбаха) наливают мочу и реактив. Пробирку закупоривают резиновой пробкой, тщательно размешивают (не взбивая!) и оставляют в вертикальном положении до следующего дня. Отчитывают деление, до которого доходит столбик белкового осадка. Найденное число показывает содержание белка. Очень важно при методе Эсбаха, чтобы моча была кислой. Щелочная моча может нейтрализовать кислые составные части реактива и воспрепятствовать осаждению белков.

Преимущества метода: он прост и удобен на практике.

Недостатки: метод неточен, результат получается через 24 - 48 часов.

Метод Брандберга-Стольникова . Он основан на качественной пробе Геллера. Проба Геллера может быть использована для количественного определения, т. к. она дает положительный результат при содержании белка выше 3,3 мг%. Это предельная концентрация белка, ниже которой проба становится отрицательной.

Модификация Эрлиха и Альтгаузена . Советские ученые С. Л. Эрлих и А. Я. Альтгаузен модифицировали метод Брандберга-Стольникова, указав возможности упрощения исследования и экономии времени при его производстве.

Первое упрощение связано с временем появления кольца. Определяется точно время его появления, не придерживаясь непременно 2-ой и 3-ей минуты.

Второе упрощение дает возможность установить, какое следует сделать разведение. Авторы доказали, что по виду полученного кольца можно приблизительно установить необходимое разведение. Они различают нитевидное, широкое
и компактное кольцо.

Из нефелометрических методов заслуживает быть отмеченным метод Кингсбэрри и Кларка . В небольшой градуированный цилиндр наливают 2,5 мл фильтрованной мочи, пополняют 3% водным раствором сульфосалициловой кислоты до 10 мл. Тщательно размешивают и через 5 минут фотометрируют в 1 см кюветке, при желтом фильтре, употребляя воду в качестве компенсационной жидкости. При фотометре Пульфриха найденная экстинкция, умноженная на 2,5, дает количество белка в %о. В том случае, когда экстинкционный показатель выше 1,0, моча предварительно разводится в 2 раза, в 4 раза или еще больше.

Для того, чтобы иметь ясное представление о количестве выделенных в моче белков, необходимо определить не только их концентрацию в отдельной порции мочи, но и их общее суточное количество. Для этого собирают мочу больного в продолжение 24 часов, измеряют ее объем в миллилитрах и определяют концентрацию белка в порции суточной мочи в г%. Количество выделенных в моче за 24 часа белков определяется в зависимости от суточного количества мочи в граммах.

Клиническое значение белка в моче

Моча человека нормально содержит минимальные количества белка, которые не могут быть установлены обыкновенными качественными пробами исследования белка в моче. Выделение больших количеств белка, при которых обыкновенные качественные пробы на белок в моче становятся положительными - явление ненормальное, называемое протеинурией. Протеинурия бывает физиологической только у новорожденного, в первые 4-10 дней после рождения. Употребляемое обыкновенно название альбуминурия неправильно, т. к. в моче выделяются не только альбумины, но и другие виды белков (глобулины и пр.).

Протеинурию, как диагностический симптом, открыл в 1770 году Котуньо.

Наиболее важные функциональные почечные протеинурии у детей следующие:

1. Физиологическая протеинурия новорожденного . Встречается у большинства новорожденных и не имеет неблагоприятного значения. Объясняется неокрепшим почечным фильтром, повреждением при рождении или потерей жидкостей в первые дни жизни. Физиологическая протеинурия исчезает на 4-10-ый день после рождения (у недоношенных детей позже). Количество белка невелико. Он представляет собой нуклеоальбумин.

Неонатальная альбуминурия, продолжающаяся долгое время, может быть симптомом конгенитального люэса.

2. Инсультные альбуминурии . Они вызываются превышением порога нормальной раздражимости почечного фильтра значительными механическими, термическими, химическими, психическими и другими раздражениями - потерей жидкости у грудных детей (дегидрационная протеинурия), холодным купанием, обильной, богатой белками пищей (алиментарная протеинурия), пальпацией почки (пальпаторная альбуминурия), физическим переутомленном, страхом и т. д.

Инсультные альбуминурии легче появляются у детей в раннем возрасте, чем у детей в старшем возрасте и у взрослых, так как почки грудного и маленького ребенка легче поддаются раздражениям. Дегидрационная альбуминурия (нарушение кормления, гидрелабилитет, токсикозы, поносы , рвоты) особенно часто наблюдается у грудных детей.

Инсультные альбуминурии доброкачественны. Они исчезают сейчас же после устранения вызывающих их причин. В осадке иногда находятся единичные лейкоциты, цилиндры и эритроциты. Белок чаще всего представляет собой нуклеоальбумин.

3. Ортостатическая протеинурия . Это состояние характерно для детей дошкольного и школьного возрастов. Оно возникает на почве вазомоторных нарушений кровоснабжения почки. Типическим для ортостатической альбуминурии (отсюда и ее название) является то, что она появляется только при стоячем положении ребенка, когда позвоночник занимает лордотическое положение. В лежачем положении она исчезает. Выделяется нуклеоальбумин. В сомнительных случаях можно прибегнуть к ортостатическому опыту, который заключается в следующем: вечером, за час до того как лечь, ребенок опоражнивает мочевой пузырь; утром, вставая с постели, он снова выпускает мочу. Эта моча не содержит белка. Затем ребенка ставят на колени в продолжение 15-30 минут с палкой за спиной, между согнутыми локтями обеих рук. Создается положение лордоза, которое приводит к выделению белка, без изменений в осадке.

При ортостатической альбуминурии в сутки может выделяться 8-10 г белка.

Важнейшее клиническое значение между всеми протеинуриями имеют органические почечные протеинурии. Они вызываются органическими заболеваниями почек (нефритами, нефрозами, нефросклерозами). Протеинурия является одним из самых важных и самых известных симптомов органических заболеваний почек.

1. При остром и хроническом гломерулонефрите протеинурия встречается регулярно. Количество белка умеренное, причем не наблюдается параллельности между степенью протеинурии и тяжестью заболевания. Напротив, хронические и более тяжелые нефриты часто протекают с меньшими количествами белка, чем острые. После острого нефрита , иногда в продолжение долгого времени (годами), устанавливаются небольшие количества белка в моче, не имеющие патологического значения ("остаточная альбуминурия"). Не следует забывать, что могут встречаться и "нефриты без протеинурии". Иногда белок обнаруживается в одной порции мочи, а в другой его нет. Отношение альбуминов к глобулинам при острых нефритах невысоко, а при хронических нефритах выше.

2. При нефросклерозе количество белков в моче совсем незначительно, часто встречаются формы болезни без белка в моче.

3. Из всех почечных заболеваний нефрозы протекают с наиболее выраженной протеинурией.

4. При инфекционных и токсических состояниях встречаются так называемые лихорадочные и токсические протеинурии. Это острые нефрозы, при которых количество белка невелико. К этой группе относятся и протеинурии при конвульсивных состояниях (судорогах), при гиперфункции щитовидной железы, желтухах, инвагинациях, энтероколитах, ожогах , тяжелых анемиях и т. д. Эти альбуминурии доброкачественны и быстро проходят (транзиторные альбуминурии).

5. При застое крови в почках встречается так называемая застойная альбуминурия, характерная для сердечно больных в стадии декомпенсации. Она встречается также при асцитах и опухолях живота.

При лихорадочных, токсических и застойных альбуминуриях особенно сильно выражена повышенная проницаемость почечного фильтра. По мнению некоторых авторов, многие на этих протеинурии протекают без органического повреждения паренхимы почек.

Внепочечные альбуминурии вызываются обыкновенно белковыми примесями (секрециями, распавшимися клетками), которые выделяются заболевшими мочевыми путями и половыми органами. Чаще встречаются внепочечные альбуминурии вследствие цистопиелитов (пиурии), реже вследствие вульвовагинитов, конкрементов и опухолей мочевых путей.

При внепочечной альбуминурии в осадке находят большое количество лейкоцитов и бактерий. Почечные элементы почти не встречаются. Количество белка невелико. Фильтрованная или центрифугированная моча обыкновенно не дает положительной пробы на белок.

У выздоравливающих от пиелита альбуминурия исчезает после бактериурии и пиурии.

Следует подчеркнуть как характерное явление, что в раннем детском возрасте органические почечные заболевания появляются чрезвычайно редко, поэтому и органические протеинурии также редки. Из них встречаются, главным образом, лихорадочные и токсические. В отличие от органических протеинурии, у детей в раннем возрасте очень сильно распространены инсультные альбуминурии.

У детей старшего возраста органические протеинурии чаще функциональных. Вообще с возрастом функциональные протеинурии встречаются реже, а органические чаще.

Электрофоретические исследования белков в моче

Ряд авторов пользуются электрофоретическим методом для исследования белков в моче (уропротеинов). Из полученных электрофореграмм видно, что они имеют тот же качественный состав, как и белки плазмы. Это указывает на то, что белки в моче происходят из плазменных белков.

Множество заболеваний протекают без выраженных клинических проявлений, поэтому определение белка в моче с целью своевременного выявления и лечения патологического состояния является важным моментом для практической медицины.

Белок в моче может определяться качественными и количественными методами.

Качественные методы

На данный момент существует около 100 известных качественных реакций на белок. Они заключаются в осаждении протеина методом физических или химических воздействий. При положительной реакции происходит помутнение.

Наиболее информативными являются пробы:

1. С сульфосалициловой кислотой. Считается наиболее чувствительной и с ее помощью возможно определение даже самых незначительных количеств белковых тел в моче. Описание результата при следовом присутствии протеина обозначается термином «опалесценция», а при большем количестве — «слабо положительная», «положительная» и при большой потере белка с мочой — «сильно положительная реакция».
2. С заместителем кислоты — асептолом. В урину добавляется раствор вещества, и при образовании кольца на границе растворов, говорится о том, что проба является положительной.
3. Геллера. Производится при помощи раствора азотной кислоты. Итог проведения трактуется аналогично той, что с асептолом. Иногда кольцо может быть во время присутствия в исследуемой жидкости уратов.
4. С уксусной кислотой с добавлением селезистосинеродистого калия. При высокой концентрации мочи при проведении такой пробы, ее разбавляют, иначе может получиться ложноположительный результат, так как реакция будет на ураты и мочевую кислоту.

Неправильное проведение такой пробы часто может давать неверный результат у новорожденных детей, так как у них моча образуется с высоким содержанием мочевой кислоты.

Основные правила при проведении проб заключаются в следующем — необходимо, чтобы исследуемая моча была прозрачная, имела слабокислую среду (для этого иногда добавляют в нее небольшое количество уксусной кислоты), пробирок должно быть две для осуществления контроля.

Количественное определение

Когда проводится анализ мочи, общий белок определяется и количественными методами. Их достаточно много, но чаще всего применяются следующие:

1. Метод Эсбаха. Используется еще с 19 века. Для этого в определенную пробирку наливается моча и реактив. Потом смесь немного взбалтывают, и в закрытом виде оставляют на 24−48 часов. Полученный осадок считается по делению на пробирке. Правильный вывод можно сделать только при кислой моче. Такая методика достаточно проста, но не имеет высокой точности и требует затрат времени.
2. Метод Брандберга-Стольникова. Основан на пробе Геллера, которая позволяет получить результат при концентрации протеина более 3,3 мг%. Позднее такой способ был модифицирован и упрощен.
3. Широко используются нефелометрические методы установления количества белка.

Для полного понимания количества протеина, лучше всего использовать анализ мочи на суточный белок.

Для правильного результата первая утренняя порция выливается, сбор начинается со второй порции в одну емкость, которую рекомендуется держать в холодильнике.

Последняя порция собирается утром. После этого необходимо измерить объем, затем тщательно перемешать, и отлить в баночку порцию не более 50мл. Эту емкость и следует сдать в лабораторию. На специальном бланке требуется указать результаты общего объема суточной мочи, а также рост и вес пациента.

Применение тест-полосок

Тест на белок в моче действует по принципу индикаторов. Специальные полоски могут изменять свою окраску в зависимости от концентрации протеина. Они удобны для определения изменений, которые происходят в разное время, и применяются как в условиях дома, так и любых лечебных и профилактических учреждениях.

Тестовые мочевые полоски используются при необходимости раннего определения и отслеживания результатов лечения при мочеполовых патологиях. Такая методика диагностики является чувствительной, и реагирует на альбумин в его концентрации от 0,1 г/л., и позволяет определить качественное и полуколичественное изменение содержания в моче белка.

По результатам этой диагностики можно контролировать эффективность терапии, вносит в нее поправки, и назначить необходимую диету.

Является одним из наиболее важных и постоянных признаков заболеваний почек и мочевых путей. Определение концентрации белка в моче является обязательным и важным элементом исследования мочи. Выявление и количественная оценка протеинурии важна не только в диагностике многих первичных и вторичных заболеваний почек, оценка изменения выраженности протеинурии в динамике несет информацию о течении патологического процесса, об эффективности проводимого лечения. Обнаружение белка в моче даже в следовых количествах должно настораживать в отношении возможного заболевания почек или мочевых путей и требует повторного анализа. Особо следует отметить бессмысленность исследования мочи и, в частности, определения белка мочи без соблюдения всех правил ее сбора .

Все методы определения белка в моче можно разделить на:

• Качественные,
• Полуколичественные,
• Количественные.

Качественные методы

Все качественные пробы на белок в моче основаны на способности белков к денатурации под влиянием различных физических и химических факторов. При наличии белка в исследуемом образце мочи появляется либо помутнение, либо выпадение хлопьевидного осадка.

Условия определения белка в моче на основе реакции коагуляции:

1. Моча должна иметь кислую реакцию . Мочу щелочной реакции подкисляют несколькими (2 - 3) каплями уксусной кислоты (5 – 10%).
2. Моча должна быть прозрачной. Помутнение устраняется через бумажный фильтр. Если помутнение не исчезает, добавляют тальк или жженую магнезию (около 1 чайной ложки на 100 мл мочи), взбалтывают и фильтруют.
3. Качественную пробу следует проводить в двух пробирках, одна из них – контрольная.
4. Искать помутнение следует на черном фоне в проходящем свете.

К качественным методам определения белка в моче относятся:

• проба с кипячением, и другие.

Как показывают многочисленные исследования, ни один из большого числа известных методов качественного определения белка в моче не позволяет получать надежные и воспроизводимые результаты. Несмотря на это, в большинстве КДЛ в России эти методы широко используются в качестве скрининга – в моче с положительной качественной реакцией в дальнейшем проводят количественное определение белка. Из качественных реакций чаще используют пробу Геллера и пробу с сульфосалициловой кислотой, однако пробу с сульфосалициловой кислотой большей частью считают наиболее подходящей для выявления патологической протеинурии. Проба с кипячением в настоящее время практически не используется в связи с ее трудоемкостью и длительностью.

Полуколичественные методы

К полуколичественным методам относятся:

• определение белка в моче с помощью диагностических тест-полосок.

В основе метода Брандберга-Робертса-Стольникова лежит кольцевая проба Геллера, поэтому при данном методе наблюдаются те же ошибки, что и при пробе Геллера.

В настоящее время для определения белка в моче все чаще используются диагностические полоски. Для полуколичественного определения белка в моче на полоске в качестве индикатора чаще всего используется краситель бромфеноловый синий в цитратном буфере. О содержании белка в моче судят по интенсивности сине-зеленой окраски, развивающейся после контакта реакционной зоны с мочой. Результат оценивается визуально или с помощью анализаторов мочи. Несмотря на большую популярность и очевидные преимущества методов сухой химии (простота, скорость выполнения анализа) данные методы анализа мочи в целом и определения белка в частности не лишены серьезных недостатков. Одним из них, приводящих к искажению диагностической информации, является большая чувствительность индикатора бромфенолового синего к альбумину по сравнению с другими белками. В связи с этим, тест-полоски в основном приспособлены к обнаружению селективной гломерулярной протеинурии, когда практически весь белок мочи представлен альбумином. При прогрессировании изменений и переходе селективной гломерулярной протеинурии в неселективную (появление в моче глобулинов) результаты определения белка оказываются заниженными по сравнению с истинными значениями. Данный факт не дает возможности использовать данный метод определения белка в моче для оценки состояния почек (гломерулярного фильтра) в динамике. При тубулярной протеинурии результаты определения белка также оказываются заниженными. Определение белка с помощью диагностических полосок не является надежным индикатором низких уровней протеинурии (большинство выпускаемых в настоящее время диагностических полосок не обладают способностью улавливать белок в моче в концентрации ниже, чем 0,15 г/л). Отрицательные результаты определения белка на полосках не исключают присутствия в моче глобулинов, гемоглобина, уромукоида, белка Бенс-Джонса и других парапротеинов.

Хлопья слизи с высоким содержанием гликопротеидов (например, при воспалительных процессах в мочевых путях, пиурии, бактериурии) могут оседать на индикаторной зоне полоски и приводить к ложноположительным результатам. Ложноположительные результаты могут также быть связаны с высокой концентрацией мочевины . Плохое освещение и нарушение цветоощущения может быть причиной неточного результата.

В связи с этим, использование диагностических полосок следует ограничить скринирующими процедурами, а результаты, полученные с их помощью, следует рассматривать лишь как ориентировочные.

Количественные методы

Корректное количественное определение белка в моче в ряде случаев оказывается непростой задачей. Трудности ее решения определяются следующим рядом факторов:

• низким содержанием белка в моче здорового человека, часто находящимся на пороге чувствительности большинства известных методов;
• присутствием в моче множества соединений, способных вмешиваться в ход химических реакций;
• значительными колебаниями содержания и состава белков мочи при различных заболеваниях, затрудняющими выбор адекватного калибровочного материала.

В клинических лабораториях преимущественно применяются так называемые «рутинные» методы определения белка в моче, однако они далеко не всегда позволяют получать удовлетворительные результаты.

С точки зрения специалиста-аналитика, работающего в лаборатории, метод, предназначенный для количественного определения белка в моче, должен отвечать следующим требованиям:

• обладать линейной зависимостью между поглощением образовавшегося в ходе химической реакции комплекса и содержанием белка в пробе в широком диапазоне концентраций, что позволит избежать дополнительных операций при подготовке пробы к исследованию;
• должен быть прост, не требовать высокой квалификации исполнителя, выполняться при малом количестве операций;
• обладать высокой чувствительностью, аналитической надежностью при использовании небольших объемов исследуемого материала;
• быть устойчивым к воздействию различных факторов (колебаниям состава образца, присутствию лекарственных препаратов и др.);
• обладать приемлемой стоимостью;
• быть легко адаптируемым к автоанализаторам;
• результат определения не должен зависеть от белкового состава исследуемого образца мочи.

Ни один из известных к настоящему времени методов количественного определения белка в моче не может в полной мере претендовать на роль «золотого стандарта».

Количественные методы определения белка в моче можно разделить на турбидиметрические и колориметрические.

Турбидиметрические методы

К турбидиметрическим методам относятся:

• определение белка с сульфосалициловой кислотой (ССК),
• определение белка с трихлоруксусной кислотой (ТХУ),
• определение белка с бензетоний хлоридом.

Турбидиметрические методы основаны на снижении растворимости белков мочи вследствие образования суспензии взвешенных частиц под воздействием преципитирующих агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния, определяемого числом светорассеивающих частиц (нефелометрический метод анализа), либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Величина светорассеяния в преципитационных методах обнаружения белка в моче зависит от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения pH среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению относительно воспроизводимых результатов.

Некоторые лекарственные препараты влияют на результаты турбидиметрических методов определения белка в моче, приводя к так называемым «ложноположительным», либо «ложноотрицательным» результатам. К ним относятся некоторые антибиотики (бензилпенициллин, клоксациллин и др.), рентгеноконтрастирующие йодсодержащие вещества, сульфаниламидные препараты.

Турбидиметрические методы плохо поддаются стандартизации, часто приводят к получению ошибочных результатов, но, несмотря на это, в настоящее время они широко используются в лабораториях из-за невысокой стоимости и доступности реактивов. Наиболее широко в России используется метод определения белка с сульфосалициловой кислотой.

Колориметрические методы

Наиболее чувствительными и точными являются колориметрические методы определения общего белка мочи, основанные на специфических цветных реакциях белков.

К ним относятся:

1. биуретовая реакция,
2. метод Лоури,
3. методы, основанные на способности различных красителей образовывать комплексы с белками:
   • Понсо S (Ponceau S),
   • Кумасси бриллиантовый синий (Coomassie Brilliant Blue)
   • пирогаллоловый красный (Pyrogallol Red).

С точки зрения исполнителя, в повседневной работе лаборатории при большом потоке исследований биуретовый метод является неудобным из-за большого числа операций. В то же время, метод характеризуется высокой аналитической надежностью, позволяет определять белок в широком диапазоне концентраций и выявлять альбумин, глобулины и парапротеины со сравнимой чувствительностью, вследствие чего биуретовый метод рассматривают в качестве референтного и рекомендуют для сравнения других аналитических методов обнаружения белка в моче. Биуретовый метод определения белка в моче предпочтительно выполнять в лабораториях, обслуживающих нефрологические отделения, и использовать в тех случаях, когда результаты определения с помощью других методов представляются сомнительными, а также для определения величины суточной потери белка у нефрологических больных.

Метод Лоури, обладающий более высокой чувствительностью по сравнению с биуретовым методом, сочетает биуретовую реакцию и реакцию Фолина на аминокислоты тирозин и триптофан в составе белковой молекулы. Несмотря на высокую чувствительность, данный метод не всегда обеспечивает получение надежных результатов при определении содержания белка в моче. Причиной тому служит неспецифическое взаимодействие реактива Фолина с небелковыми компонентами мочи (чаще всего аминокислотами, мочевой кислотой , углеводами). Отделение этих и других компонентов мочи путем диализа или осаждения белков позволяет с успехом использовать данный метод для количественного определения белка в моче. Некоторые лекарственные препараты – салицилаты, хлорпромазин, тетрациклины способны оказывать влияние на данный метод и извращать результаты исследования.

Достаточная чувствительность, хорошая воспроизводимость и простота определения белка по связыванию красителей делают эти методы перспективными, однако высокая стоимость реактивов препятствует более широкому их использованию в лабораториях. В настоящее время в России все большее распространение получает метод с пирогаллоловым красным.

Проводя исследование уровня протеинурии, нужно иметь ввиду, что различные методы определения протеинурии имеют разную чувствительность и специфичность к многочисленным белкам мочи.

протеинурия = 0,4799 B + 0,5230 L;
протеинурия = 1,5484 B – 0,4825 S;
протеинурия = 0,2167 S + 0,7579 L;
протеинурия = 1,0748 P – 0,0986 B;
протеинурия = 1,0104 P – 0,0289 S;
протеинурия = 0,8959 P + 0,0845 L;

где:
B – результат измерения с Кумасси G-250;
L - результат измерения с реактивом Лоури;
P - результат измерения с молибдатом пирогаллола;
S - результат измерения с сульфосалициловой кислотой.

Учитывая выраженные колебания уровня протеинурии в различное время суток, а также зависимость концентрации белка в моче от диуреза, различное его содержание в отдельных порциях мочи, в настоящее время при патологии почек принято оценивать выраженность протеинурии по суточной потере белка с мочой, то есть определять так называемую суточную протеинурию. Она выражается в г/сут.

При невозможности сбора суточной мочи рекомендуется определять в разовой порции мочи концентрации белка и креатинина. Поскольку скорость выделения креатинина в течение дня достаточно постоянна и не зависит от изменения скорости мочеотделения, отношение концентрации белка к концентрации креатинина постоянно. Данное отношение хорошо коррелирует с суточной экскрецией белка и, следовательно, может использоваться для оценки выраженности протеинурии. В норме отношение белок/креатинин должно быть менее 0,2. Белок и креатинин измеряют в г/л. Важным достоинством метода оценки выраженности протеинурии по соотношению белок-креатинин является полное исключение ошибок, связанных с невозможностью или неполным сбором суточной мочи.

Литература:

• О. В. Новоселова, М. Б. Пятигорская, Ю. Е. Михайлов, "Клинические аспекты выявления и оценки протеинурии", Справочник заведующего КДЛ, № 1, январь 2007 г.
• А. В. Козлов, "Протеинурия: методы ее выявления", лекция, Санкт-Петербург, СПбМАПО, 2000 г.
• В. Л. Эмануэль, «Лабораторная диагностика заболеваний почек. Мочевой синдром», - Справочник заведующего КДЛ, № 12, декабрь 2006 г.
• В.И. Пупкова, Л.М. Прасолова - Определение белка в моче и спинномозговой жидкости. Кольцово, 2007 г.
• Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е. А. Кост. Москва, "Медицина", 1975 г.

Протеинурия (proteinuria) - появление белка в моче в концентрациях, дающих возможность выявить его качественными методами.

Различают

• Почечную протеинурию и
• Внепочечную (постренальную) протеинурию

Почечная протеинурия

Почечная протеинурия обусловлена повреждением гломерулярного фильтра или дисфункцией эпителия извитых почечных канальцев.

Выделяют селективную и неселективную протеинурию в зависимости от соотношения тех или иных плазматических и мочевых белков, их молекулярной массы и заряда.

Селективная протеинурия

Селективная протеинурия встречается при минимальном (нередко обратимом) нарушении гломерулярного фильтра, представлена низкомолекулярными белками (молекулярная масса не выше 68 000) - альбумином, церулоплазмином, трансферрином.

Неселективная протеинурия

Неселективная протеинурия чаще встречается при более тяжелом повреждении фильтра, когда начинают теряться крупномолекулярные белки. Селективность протеинурии является важным диагностическим и прогностическим признаком.

Почечная протеинурия может быть:

• органической и
• функциональной (физиологической).

Органическая почечная протеинурия

Органическая почечная протеинурия возникает при органическом поражении нефрона. В зависимости от преимущественного механизма возникновения можно выделить определенные типы органической протеинурии.

Клубочковая протеинурия

Клубочковая протеинурия - обусловлена повреждением гломерулярного фильтра, возникает при гломерулонефритах и при нефропатиях, связанных с обменными или сосудистыми заболеваниями. (гломерулонефрит, гипертоническая болезнь, действие инфекционных и аллергических факторов, декомпенсация сердечной деятельности)

Канальцевая протеинурия

Канальцевая протеинурия - связана с неспособностью канальцев реабсорбировать плазменные низкомолекулярные белки, прошедшие через неизмененный гломерулярный фильтр. (амилоидоз, острый канальцевый некроз, интерстициальный нефрит, синдром Фанкони)

Преренальная протеинурия

Преренальная протеинурия (избыточная) - развивается при наличии необычно высокой плазматической концентрации низкомолекулярного белка, который фильтруется нормальными клубочками в количестве, превышающем физиологическую способность канальцев к реабсорбции. (миеломная болезнь, некроз мышечной ткани, гемолиз эритроцитов)

Функциональная почечная протеинурия

Функциональная почечная протеинурия не связана с заболеваниями почек и не требует лечения.

К функциональным протеинуриям относят:

• маршевую,
• эмоциональную,
• холодовую,
• интоксикационную,
• ортостатическую (только у детей и только в положении стоя).

Внепочечная (постренальная) протеинурия

При внепочечных (постренальных) протеинуриях белок может попасть в мочу из мочевыводящих и половых путей (при кольпитах и вагинитах - при неправильно собранной моче). В данном случае это ни что иное, как примесь воспалительного экссудата.

Внепочечная протеинурия, как правило, не превышает 1 г/сут., часто носит преходящий характер.

Диагностике внепочечной протеинурии помогает проведение трехстаканной пробы и урологическое обследование.

Постренальная протеинурия бывает при циститах, уретритах.

Методы определения белка в моче

Необходимым условием при проведении исследований на наличие белка является абсолютная прозрачность мочи.

Качественные пробы

Проба с сульфосалициловой кислотой

В две пробирки наливают по 3–4 мл профильтрованной мочи. В опытную пробирку добавляют 6–8 капель 20% раствора сульфосалициловой кислоты. Вторая пробирка является контролем. На темном фоне сравнивают контрольную пробирку с опытной. При наличии белка в пробах мочи появляется опалесцирующая муть.

Результат обозначают следующим образом:

• реакция слабоположительная (+),
• положительная (++),
• резкоположительная (+++).

Проба обладает высокой чувствительностью.

Можно пользоваться и сухой пробой, когда к нескольким миллилитрам мочи добавляют несколько кристалликов сульфосалициловой кислоты или фильтровальную бумажку, заранее пропитанную раствором этой кислоты.

Ложноположительные результаты могут быть обусловлены приемом препаратов йода, сульфаниламидных препаратов, больших доз пенициллина и наличием в моче мочевой кислоты в высоких концентрациях.

Проба с азотной кислотой (проба Геллера)

В пробирку наливают 1–2 мл 50% раствора азотной кислоты, затем наслаивают на кислоту равное количество мочи. При наличии белка на границе двух жидкостей появляется белое кольцо. Иногда несколько выше границы между жидкостями образуется кольцо красновато-фиолетового цвета от присутствия уратов. Уратное кольцо в отличие от белкового растворяется при легком нагревании.

Проба Bright

Проба Bright с кипячением и скрининг-тесты на протеинурию (сухие колориметрические пробы) практически не требуют никаких реактивов.

При кипячении мочи, содержащей белок, он денатурируется, образуя облаковидный осадок или хлопья, не растворяющиеся в 6% уксусной кислоте, в отличие от солей фосфатов. Скрининг-тесты основаны на способности белка (альбумина) изменять цвет бумаги с нанесенным индикатором (как правило, бромфеноловым синим) и буфером. Прямая зависимость между интенсивностью окраски индикаторной бумаги (Альбуфан, Альбутест - Чехия; Labstix, Multistix - США; Comburtest - Германия) и количеством белка позволяет ориентировочно оценить и величину протеинурии. Однако применяемые в настоящее время скрининг-тесты не лишены недостатков. В частности, бромфеноловый синий не выявляет белок Бенс-Джонса.

Количественные методы

Метод Брандберга - Робертса - Стольникова

В основе метода лежит качественная проба с азотной кислотой. Ход проведения пробы описан выше. Появление тонкого кольца на границе двух жидкостей между 2-й и 3-й минутой после наслаивания указывает на наличие в моче 0,033 г/л белка (концентрацию белка в моче принято выражать в промилле, т. е. в граммах на литр). Если кольцо появилось раньше, чем через 2 мин, мочу следует развести водой. Подбирают такое разведение мочи, чтобы при наслаивании ее на азотную кислоту кольцо появилось на 2–3-й минуте. Степень разведения зависит от ширины и компактности кольца и времени его появления.

Концентрацию белка вычисляют, умножив 0,033 г/л на степень разведения мочи (табл. 8).

Метод разведения Робертса - Стольникова обладает рядом недостатков: он субъективен, трудоемок, точность определения концентрации белка снижается по мере разведения мочи.

Наиболее удобными в работе и точными являются нефелометрический и биуретовый методы.

Нефелометрический метод

Основан на свойстве белка давать с сульфосалициловой кислотой помутнение, интенсивность которого пропорциональна концентрации белка. В градуированную пробирку наливают 1,25 мл профильтрованной мочи и добавляют до объема 5 мл 3% раствор сульфосалициловой кислоты, тщательно размешивают. Через 5 мин измеряют экстинкцию на ФЭК-М (или любом другом фотометре) при длине волны 590–650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля в кювете с толщиной слоя 0,5 см. Для контроля используют 1,25 мл профильтрованной мочи (той же), к которой до объема 5 мл доливают изотонический раствор хлорида натрия.

Предварительно строят калибровочную кривую зависимости величины экстинкции от концентрации белка. Для приготовлений различных концентраций белка используют стандартный раствор альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки). Заполняют рабочую таблицу.

Биуретовый метод

Основан на способности белка давать с сульфатом меди и едкой щелочью биуретовый комплекс фиолетового цвета, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна количеству белка. К 2 мл мочи добавляют 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения белка и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают. К осадку (белку) добавляют 4 мл 3% раствора NaOH и 0,1 мл 20% раствора сульфата меди, размешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость фиолетового цвета фотометрируют при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр) против дистиллированной воды в кювете с толщиной слоя 1,0 см. Концентрацию белка определяют по таблице, полученной опытным путем (калибровочную кривую строят как в предыдущем методе).

Ортостатическая проба

Показана при подозрении на ортостатическую протеинурию и при нефроптозе. После полного опорожнения мочевого пузыря исследуемый сохраняет горизонтальное положение в течение 2 ч. Затем, не вставая, сдает одну (контрольную) порцию мочи. В течение последующих 2 ч испытуемый непрерывно ходит, сохраняя положение максимального поясничного лордоза (держит палку за поясницей), после чего сдает вторую порцию мочи. В обеих порциях мочи определяют концентрацию белка и содержание белка в граммах, а при нефроптозе - количество эритроцитов в 1 мл. При ортостатической протеинурии во второй порции обнаруживается протеинурия или увеличенное в 2–3 раза исходное содержание белка в граммах. Появление гематурии нередко в сочетании со следовой протеинурией во второй порции характерно для нефроптоза.

Определение уропротеинов Бенс-Джонса

Белки Бенс-Джонса - термолабильные низкомолекулярные парапротеины (относительная молекулярная масса 20 000–45 000), обнаруживаемые главным образом при миеломной болезни и макроглобулинемии Вальденстрема. Они представляют собой легкие L-цепи иммуноглобулинов. Благодаря небольшой молекулярной массе L-цепи легко проходят из крови через неповрежденный почечный фильтр в мочу и могут быть определены там с помощью реакции термопреципитации. Исследование целесообразно проводить только при положительной пробе с сульфосалициловой кислотой. Определение проводят следующим образом. К 10 мл мочи добавляют 3–4 капли 10% раствора уксусной кислоты и 2 мл насыщенного раствора хлорида натрия, осторожно нагревают на водяной бане, постепенно повышая температуру. Если в моче имеются белки Бенс-Джонса, то при температуре 45–60 °С появляется диффузное помутнение или выпадает плотный белый осадок. При дальнейшем нагревании до кипения осадок растворяется, а при охлаждении вновь появляется. Эта проба недостаточно чувствительна и должна проверяться методами электрофореза и иммуноэлектрофореза.